Введение
2. Литературный обзор
2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений 10
2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования 11
2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки
2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла 13
2.3.2. Трехпетлевые токсины змей 14
2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным а/р-мотивом 15
2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных 16
2.4. Полипептиды Кунитц-типа 16
2.4.1. Структура 17
2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами 18
2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие
2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа 21
2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей 22
2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков 25
2.4.3.4. Полипептиды Кунитц-типа яда скорпионов 27
2.4.3.5. Полипептиды Кунитц-типа яда конусов 28
2.4.3.6. Полипептиды Кунитц-типа земноводных 29
2.4.3.7. Полипептиды Кунитц-типа яда перепончатокрылых 30
2.4.3.8 . Полипептиды Кунитц-типа яда актиний 31
2.5. Молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа актиний 34
2.5.1. Сериновые протеиназы 34
2.5.1.1. Классификация 34
2.5.1.2. Механизм катализа гидролитического расщепления пептидной связи 35
2.5.1.3. Функциональное разнообразие 37
2.5.2. Ионные каналы - молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа 38
2.5.2.1. Общая характеристика ионных каналов 39
2.5.2.2. Потенциалзависимые ионные каналы. Kv каналы 40
2.5.2.3. Рецептор TRPV1 43
2.5.2.4. Структура и функциональные детерминанты TRPV1 44
2.5.2.5. Терапевтический потенциал агонистов и антагонистов TRPV1 47
3. Обсуждение результатов 48
3.1. Выделение ингибиторов Кунитц-типа из актинии Н. crispa 48
3.2. In silico исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки//, crispa
3.2.1. Сравнительная характеристика структурных и функциональных особенностей 52
3.2.2. Компьютерное моделирование пространственных структур полипептидов Кунитц-типа актиний 55
3.2.3. Расчетные физико-химические характеристики HCGS-полипептидов 56
3.2.4. Анализ молекулярного электростатического потенциала 57
3.2.5. Установление структурно-функциональных взаимосвязей
3.2.5.1. Структурные модели комплексов с а-химотрипсином 61
3.2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином 64
3.2.5.3. Структурные модели комплексов сэластазой нейтрофилов человека 70
3.2.5.4. Структурные модели комплексов с рецептором TRPV1 77
3.3. Получение рекомбинантных полипептидов семейства Кунитца//. crispa. Исследование физико-химических характеристик и биологической активности 88
3.3.1. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе кДНК 88
3.3.2. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе синтетических генов 92
3.3.3. Определение констант ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами 95
3.3.4. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами методом поверхностного плазмонного резонанса 97
3.3.5. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов 98
4. Экспериментальная часть 102
4.1. Материалы и реактивы 102
4.2. Биологический материал, бактериальные штаммы и животные 103
4.3. Приборы и оборудование 104
4.4. Методы исследования
4.4.1. Выделение природных ингибиторов Кунитц-типа 104
4.4.2. Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа 106
4.4.3. Методы получения рекомбинантных полипептидов и определения их физико-химических характеристик и биологической активности 107
4.4.4. Методы тестирования анальгетическои активности 115
5. Заключение 116
6. Выводы 117
7. Список литературы 119
