ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 6
1.1. Актуальность темы исследования ..................................................................... 6
1.2. Цель работы и поставленные задачи ................................................................ 9
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы .................................. 10
1.4. Положения, выносимые на защиту ................................................................. 10
1.5. Апробация работы ............................................................................................ 11
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................ 13
2.1. Кондиционирующая терапия ........................................................................... 13
2.1.1. Введение ...................................................................................................... 13
2.1.2. Режимы кондиционирования .................................................................... 14
2.2. Общий лейкоцитарный антиген CD45 ........................................................... 18
2.2.1. Структура CD45 .......................................................................................... 18
2.2.2. Роль CD45 в онкогематологических заболеваниях ................................. 21
2.2.3. Функции CD45 в Т и NK клетках ............................................................. 22
2.2.4. Участие CD45 в передаче сигнала ТКР и CAR ....................................... 25
2.2.5. CD45 как мишень для CAR ....................................................................... 28
2.3. CAR T клеточная терапия ................................................................................ 29
2.3.1. Химерный антигенный рецептор .............................................................. 29
2.3.2. Недостатки аутологичных CAR T клеток ................................................ 33
2.3.3. CD45 как маркер популяций Т клеток ...................................................... 35
2.4. Заключение ........................................................................................................ 37
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................... 38
3.1. Коммерческие реактивы и наборы .................................................................. 38
3.2. Растворы внутрилабораторного приготовления ............................................ 40
3
3.3. Методы работы с нуклеиновыми кислотами ................................................. 41
3.3.1. Полимеразная цепная реакция .................................................................. 41
3.3.2. Электрофорез в агарозном геле ................................................................ 42
3.3.3. Рестрикция ..................................................................................................... 42
3.3.4. Лигирование .................................................................................................. 43
3.3.5. Трансформация клеток E.coli ....................................................................... 43
3.3.6. Скрининг колоний ......................................................................................... 43
3.3.7. Наработка и выделение плазмидной ДНК ................................................. 44
3.4. Методы работы с белками ................................................................................ 44
3.4.1. Вестерн-блоттинг ....................................................................................... 44
3.4.2. Иммуноферментный анализ ...................................................................... 45
3.5. Методы работы с эукариотическими клетками ............................................. 46
3.5.1. Культивирование ......................................................................................... 46
3.5.2. Заморозка и разморозка клеток ................................................................. 48
3.5.3. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека, Т и NK клеток ............................................................................................................. 49
3.5.4. Нокаут генов ................................................................................................ 50
3.5.5. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток и проточная цитофлуориметрия .................................................................................................. 51
3.5.6. Анализ неспецифической активности CRISPR/Cas9 и секвенирование по Сэнгеру после нокаута ....................................................................................... 52
3.5.7. Конфокальная микроскопия ...................................................................... 53
3.5.8. Анализ РНК ................................................................................................. 53
3.5.9. Получение псевдовирусных частиц ......................................................... 54
3.5.10. Определение титра псевдовирусных частиц ........................................ 55
4
3.5.11. Трансдукция клеток псевдовирусными частицами ............................. 56
3.5.12. Анализ экспансии CAR T клеток ........................................................... 57
3.5.13. Внутриклеточная детекция провоспалительных цитокинов .............. 58
3.5.14. Анализ дегрануляции CAR T клеток ..................................................... 59
3.5.15. Анализ цитотоксичности ........................................................................ 59
3.5.16. Стресс-тест или Sequential killing .......................................................... 60
3.6. Методы работы с животными .......................................................................... 61
3.7. Статистический анализ .................................................................................... 63
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................................................... 64
4.1. Введение ............................................................................................................ 64
4.2. Получение, оценка функциональности и терапевтического потенциала CD45Δ CAR45 T клеток и CD45Δ CAR45 NK клеток.............................................. 64
4.2.1. Создание CD45Δ T клеток .......................................................................... 64
4.2.2. Редактирование гена CD45 не приводит к нарушению функций Т клеток 69
4.2.3. Нокаут гена CD45 не нарушает цитотоксическую функцию CD45Δ CAR19 Т клеток in vitro .......................................................................................... 71
4.2.4. Нокаут гена CD45 не нарушает цитотоксическую функцию CD45Δ CAR19 Т клеток in vivo .......................................................................................... 74
4.2.5. Создание CD45Δ CAR45 T клеток ............................................................. 77
4.2.6. CD45Δ CAR45 T клетки эффективнее CAR45 Т клеток лизируют CD45-позитивные клетки крови человека in vitro .......................................................... 84
4.2.7. CD45Δ CAR45 NK клетки лизируют нетрансформированные CD45-позитивные гемопоэтические клетки человека in vitro ....................................... 90
4.2.8. CD45Δ CAR45-Т-клетки эффективнее CAR45 Т клеток элиминируют CD45-позитивные гемопоэтические клетки человека in vivo ............................ 93
5
4.3. Исследование терапевтического потенциала аллогенных CAR19 T клеток, произведенных из CD45RA-негативных Т клеток памяти .................................... 98
4.3.1. История пациентов для терапии аллогенными CAR19 Tm клетками ... 98
4.3.2. Полученные CAR19 Tm клетки отличаются по составу поверхностных маркеров от CAR19 T клеток ................................................................................. 99
4.3.3. CAR19 Tm клетки эффективно элиминируют B клеточный острый лимфобластный лейкоз и не вызывают тяжелой РТПХ .................................... 101
4.3.4. CAR19 Tm клетки не уступают CAR19 T клеткам в реакциях активации и немедленной цитотоксичности, но быстрее теряют способность лизировать таргетные клетки при повторной инкубации с ними ........................................ 102
4.3.5. CAR19 Tm клетки значительно отличаются от CAR19 T клеток по экспрессии ряда маркеров – фенотипа, истощения, цитокинов и др. ............. 105
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 108
6. ВЫВОДЫ ................................................................................................................ 111
СОКРАЩЕНИЯ ........................................................................................................... 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 114
ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................................................... 132
Приложение А .......................................................................................................... 132
Приложение Б ........................................................................................................... 134
Приложение В ........................................................................................................... 135
