Введение
Обзор литературы 9
Протеасома 9
Структура и каталитические свойства протеасомы 9
Иммунопротеасома 14
Система убиквитинилирования. Убиквитин-зависимый и убиквитин-независимый протеолиз Ингибиторы протеасомы 20
Презентация антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимости 25
Рассеянный склероз 31
Общая характеристика заболевания 31
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит 33
Роль Т-клеток в развитии рассеянного склероза и ЕАЕ 34
Основной белок миелина 37
Роль протеасомы в развитии РС и EAE 40
Современные подходы к терапии рассеянного склероза 42
Результаты и обсуждение 46
Исследование роли модификации МВР убиквитином в процессе деградации протеосомой 46
Внутриклеточная деградация MBP протеасомой в клетках млекопитающих 46
Протеолиз MBP 26S протеасомой in vitro 52
Изучение влияния заряда МВР на эффективность убиквитин-независимого протеолиза 54
Анализ физиологической значимости деградации МВР иммунопротеасомой 59
Изучение баланса протеасома-иммунопротеасома в ЦНС при развитии ЕАЕ. 59
Локализация иммуносубъединиц иммунопротеасомы в структурах головного мозга на клеточном уровне 62
Сравнение спектров деградации MBP конститутивной протеасомой и иммунопротеасомой 63
Исследование образования пептида MBP83-90 под действием иммунопротеасомы
субъединичного состава 1ihigh5ilow 68
Свидетельство презентации пептида MBP83-90 на MHC I и анализ цитотоксического действия
MBP83-90-специфических T-клеток на олигодендроциты. 69
Подходы к направленному подавлению гидролиза МВР протеасомой для терапии ЕАЕ 72
Использование малых интерферирующих РНК 72
Использование ингибиторов протеасомы 73
Материалы и методы. 79
Химические реактивы и сопутствующие материалы. 79
Растворы 81
Работа с белками 82
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле. 82 Окрашивание ПААГ Кумасси синим R-250 с усилением контраста солью меди 83
Иммуноблоттинг 83
Электрофорез в неденатурирующих условиях 83
Иммунопреципитация 84
Работа с эукариотическими клетками. 84
Методы работы с эукариотическими клетками линии HEK и HeLa 84
Получение культуры зрелых олигодендроцитов 85
Получение активированных CD8+ Т-клеток. 86
Определение цитотоксической активности CD8+ T-клеток. 86
Иммуноцитохимическое окрашивание культур олигодендроцитов 87
Индукция ЕАЕ у экспериментальных мышей 87
Иммуногистохимия 87
Получение очищенного препарата протеасомы 88
Фракционирование протеасомы ультрацентрифугированием 89
Выделение, ацетилирование и деиминирование MBP 89
Убиквитинилирование in vitro 90
Протеолиз белков in vitro 90
Определение кинетических параметров ингибирования протеасомы 91
Методы масс-спектрометрического анализа 92
Тандемный хромато-масс-спектрометрический анализ 92
Масс-спектрометрический aнализ нативного белка (Top-down). 93
Масс-спектрометрия с мониторингом множественных реакций 93
Поверхностный плазмонный резонанс 94
Заключение 95
Выводы 97
Список литературы 98
