Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Фуллерены 15
1.1.1. Синтез фуллеренов 15
1.1.2. Токсичность 16
1.1.3. Антиоксидантные свойства производных фуллеренов 21
1.1.4. Противораковые свойства 23
1.1.5. Противовирусная активность 25
1.1.6. Использование производных фуллеренов в качестве векторов для доставки лекарств 29
1.1.7. Другие потенциальные применения производных фуллеренов в медицине 31
1.1.8. Модели для исследования фуллеренов 34
1.1.9. Сигнальные пути и транскрипционные факторы, активирующиеся в клетках под влиянием производных фуллеренов 36
1.2. Транскрипционные факторы, ответственные за миогенную дифференцировку (Myog, MyoD, MYF5, MRF4) 39
1.3. Ферменты, принимающие участие в синтезе АФК, NOX4 40
1.4. Заключение по данным литературы 41
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Объект исследований 42
2.2. Определение флуоресценции 43
2.3. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток 43
2.4. Культивирование эмбриональных фибробластов легкого человека 43
2.5. Культивирование клеток линии MCF7 рака молочной железы 43
2.6. Инкубация клеток с фуллеренами 44
2.7. МТТ-тест 44
2.8. Определение количества активных форм кислорода 44
2.9. Определение одно- и двуцепочечных разрывов днк методом комет 45
2.10. Связывание аннексина V 45
2.11. Метод -фокусов 45
2.12. Выделение РНК и определение ее концентрации 46
2.13. Обратная транскрипция 46
2.14. Определение уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 46
2.15. Определение уровня экспрессии белков 49
2.16. Флуоресцентная микроскопия 50
2.17. Статистическая обработка результатов 50
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Водорастворимые производные фуллерена С60 обладают способностью флуоресцировать в клетках 51
3.1.1. Соединения, флуоресцирующие и в воде, и в живых клетках 51
3.1.2. Водорастворимые производные фуллерена, флуоресцирующие в клетках, но не обладающие флуоресценцией в водных растворах 63
3.1.3. Водорастворимое производное фуллерена, которое обладает способностью прокрашивать ядра клеток и может быть использовано в качестве витального красителя 66
3.2. Токсичность водорастворимых производных фуллеренов в отношении флэч 68
3.3. Влияние водорастворимых производных фуллерена на синтез активных форм кислорода и на экспрессию генов, отвечающих за развитие окислительного стресса в клетках ФЛЭЧ 74
3.3.1. Исследование влияния соединений GI-761 и VI-419-P3K на синтез активных форм кислорода и на экспрессию (на уровне РНК и белка) генов, отвечающих за развитие окислительного стресса (семейства NOX) в ФЛЭЧ 76
3.3.2. Исследование влияния производных фуллерена OKR-111 и VI-434K2 на синтез активных форм кислорода и на экспрессию (на уровне РНК и белка) генов, отвечающих за развитие окислительного стресса (семейства NOX) в культивируемых ФЛЭЧ 88
3.3.3. Механизм развития ответа эмбриональных фибробластов легких человека на добавление водорастворимых производных фуллерена C60 к среде культивирования клеток 93
3.4. Влияние фуллеренов на экспрессию (на уровне РНК и белка) генов, отвечающих за развитие антиокислительного ответа в культивируемых фибробластах легкого эмбриона человека 101
3.4.1. Влияние фуллеренов на экспрессию фермента супероксиддисмутаза-1 (SOD1) 105
3.5. Влияние производных фуллеренов на образование разрывов ДНК клеток ФЛЭЧ и процессы репарации разрывов ДНК 111
3.5.1. Влияние производного фуллерена GI-761 на образование разрывов ДНК клеток ФЛЭЧ 112
3.5.2. Активация систем репарации ДНК ядер клеток при действии водорастворимого производного GI-761 116
3.5.3. Влияние производных фуллерена OKR-111 и OKR-112 на окисление и образование разрывов ДНК клеток ФЛЭЧ 117
3.5.4. Влияние производных фуллерена OKR-111 и OKR-112 на репарацию ДНК ядер клеток ФЛЭЧ 119
3.5.5. Отсутствие разрывов в ДНК ядер ФЛЭЧ при действии производными фуллерена VI-434K2 и VI-419-P3K 119
3.5.6. Исследование разрывов в ДНК ядер клеток ФЛЭЧ с депривацией сыворотки при культивировании с F-8 119
3.5.7. Исследование репарации ДНК ядер клеток ФЛЭЧ с депривацией сыворотки при культивировании с F-828 121
3.5.8. Влияние производного фуллерена F-828 в бессывороточной среде на пролиферативную активность ФЛЭЧ 121
3.5.9. Влияние водорастворимого производного F-828 на клеточный цикл в клетках ФЛЭЧ 124
3.5.10. Влияние водорастворимого производного F-828 на количество транскрипционного фактора Р53 в клетках ФЛЭЧ 125
3.5.11. Влияние фуллеренов на экспрессию генов про- и антиапоптотического ответа во ФЛЭЧ и возможное развитие адаптивного ответа 127
3.6. Влияние производного фуллерена F-828 на активность транскрипционных факторов NF-B на уровне РНК, белка, локализации в клетках и содержания фосфорилированных форм 128
3.6.1. Исследовано влияние фуллеренов на процессы аутофагии клеток 130
3.6.2. Производное фуллерена F-828 усиливает экспрессию генов сигнального каскада Rho / Rock и Smad в эмбриональных фибробластах легкого человека 131
3.7. Влияние водорастворимых производных фуллерена на МСК человека 133
3.7.1. Влияние водорастворимых производных фуллерена на дифференцировку МСК 133
3.7.1.1. Влияние водорастворимого производного фуллерена F-827 на экспрессию транскрипционного фактора MYOD 134
3.7.1.2. Влияние водорастворимого производного фуллерена F-827 на экспрессию транскрипционного фактора MYF5 136
3.7.1.3. Влияние водорастворимого производного фуллерена F-827 на экспрессию транскрипционного фактора MYOG 138
3.7.1.4. Влияние водорастворимого производного фуллерена F-827 на экспрессию транскрипционного фактора MRF4 139
3.7.1.5. Фуллерен F-827 снижает или не изменяет уровень экспрессии генов адипогенной и остеогенной дифференцировки 139
3.7.1.6. Способность фуллерена F-827 ингибировать активные формы кислорода способствует миогенной дифференцировке МСК 142
3.7.1.7. Аутофагия способствует миогенной дифференцировке МСК 144
3.8. Влияние водорастворимых производных фуллерена С60 на раковые клетки линии MCF7 145
3.8.1. Водорастворимое производное фуллерена С60 F-243 вызывает увеличение уровня АФК в клетках MCF7, повышая экспрессию NOX4-оксидазы 146
3.8.2. Водорастворимые производные фуллерена С60 вызывают повреждения ДНК клеток MCF7 148
3.8.3. Водорастворимые производные фуллерена С60 вызывают остановку клеточного цикла и снижение активности систем репарации в MCF7 149
3.8.4. Водорастворимые производные фуллерена С60 вызывают снижение мембранного потенциала в митохондриях MCF7 150
3.8.5. Водорастворимые производные фуллерена С60 вызывают снижение антиокислительного ответа в MCF7 151
3.8.6. Водорастворимые производные фуллерена С60 вызывают транслокацию NF-B и STAT3 в ядро в MCF7 152
Заключение 154
Выводы 157
Применение результатов и научных выводов 158
Список литературы 160
