Введение
ГЛАВА 1. Альдоксим-нитрильный метаболизм почвенных бактерий 12
1.1. Ключевые ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма 14
1.1.1. Классификация и характеристика альдоксимдегидратаз 15
1.1.2. Классификация и характеристика нитрилгидратаз
1.2. Молекулярные основы метаболизма нитрилов 20
1.3. Микроорганизмы, утилизирующие азотсодержащие производные карбоновых кислот 26
1.4. Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты
1.4.1. Бактериологические методы 30
1.4.2. Молекулярно-генетические методы 31
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 37
2.1. Выделение бактериальных культур 37
2.2. Условия культивирования бактерий 39
2.3. Трансформация субстратов 39
2.4. Определение общей токсичности почвы 40
2.5. Определение токсичности нитрилов
2.5.1. Биотестирование 41
2.5.2. Оценка минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций токсикантов 42
2.5.3. Атомно-силовая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 42
2.6. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную
микробиоту з
2.7. Выделение ДНК 44
2.7.1. Выделение ДНК из клеток бактерий 44
2.7.2. Выделение тотальной ДНК из почвы 45
2.8. Полимеразная цепная реакция 46
2.8.1. ПЦР с детекцией по конечной точке 46
2.8.2. ПЦР в реальном времени 49
2.9. Определение нуклеотидной последовательности генов универсальной 16S
рРНК и функциональных генов 50
2.10. Метагеномный анализ 51
2.11. Статистическая обработка 51
ГЛАВА 3. Распространение альдоксим-нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой 53
3.1. Распространение бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов, в почвах умеренной и степной зон 53
3.2. Биоиндикация почвенной среды с использованием нитрилутилизирующих бактерий 57
3.3. Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий 61
3.3.1. Трансформация ряда субстратов 62
ГЛАВА 4. Генетическая характеристика альдоксимдегидратазы и нитрилгидратазы 70
4.1. Детекция генов, кодирующих ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма 70
4.2. Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus 74
4.3. Характеристика нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus 76
ГЛАВА 5. Изучение структуры микробного сообщества загрязненных почв 86
5.1. Микробиота почв с разной антропогенной нагрузкой 86
5.2. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микрофлору 89
5.3. Метагеномное секвенирование 99
ГЛАВА 6. Влияние синтетических нитрилов на морфологию и жизнеспособность некоторых видов бактерий 102
6.1. Влияние субстратов на жизнеспособность бактерий 102
6.2. Микроскопические методы оценки токсичности нитрилов 107
Заключение 114
Выводы 121
Список сокращений 122
Список литературы 123
