Введение
Глава 1 Обзор литературы 17
1.1 Поверхностные антигены холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп 17
1.2 Диагностика холеры на основе современных иммунологических методов 33
Собственные исследования 47
Глава 2 Материалы и методы 47
2.1 Экспериментальные животные 47
2.2 Клеточные линии позвоночных 47
2.3 Штаммы микроорганизмов и антигены 48
2.4 Генетическая характеристика штаммов холерных вибрионов 49
2.5 Питательные среды и реактивы 50
2.6 Гибридизация клеток 50
2.7 Клонирование гибридом 51
2.8 Культивирование гибридом in vitro и in vivo 51
2.9 Криоконсервирование гибридом 52
2.10 Подъем из жидкого азота гибридом 52
2.11 Очистка специфических иммуноглобулинов 53
2.12 Маркировка иммуноглобулинов пероксидазой хрена 53
2.13 Серологические методы: слайд-агглютинация, реакция непрямой иммунофлуоресценции, реакция преципитации 53
2.14 Иммуноферментные методы 54
2.15 Дот-иммуноанализ 55
2.16 Электрофорез 56
2.17. Изотипирование МКА 57
2.18 Определение эпитопной направленности МКА в иммуноблоттинге 57
2.19 Статистическая обработка результатов 57
Глава 3 Гибридомы-продуценты МКА к антигенам V. cholerae O1 и O139 58
3.1 Восстановление из замороженного состояния, пассирование in vitro и in vivo, реклонирование гибридом-продуцентов видоспецифических МКА О1 и О139 58
3.2 Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих МКА к поверхностным антигенным детерминантам V. cholerae O1и O139 60
3.3 Оценка продукции специфических иммуноглобулинов гибридомами в условиях in vitro 62
3.4 Характеристика МКА, направленных к поверхностным антигенным детерминантам V. cholerae O1 и O139 64
3.4.1 Определение специфичности и активности МКА в иммуноферментном анализе на наборе штаммов холерных вибрионов О1, О139 серогрупп с определенной генетической характеристикой 64
3.4.2 Определение класса специфических иммуноглобулинов 68
3.4.3 Изучение эпитопной направленности моноклональных антител методом ИФА и иммуноблоттинга 69
3.5 Накопление, выделение и очистка специфических иммуноглобулинов 75
3.5.1 Получение и накопление в препаративных количествах МКА в виде асцитических жидкостей 75
3.5.2 Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов 78
3.6 Оценка специфичности и чувствительности МКА О1 и МКА О139 в иммунохимических реакциях на наборе штаммов холерных вибрионов О1, О139 серогрупп и представителях близкородственных микроорганизмов 79
Глава 4 Получение моноклональных пероксидазных конъюгатов 81
4.1 Оптимизация условий получения пероксидазных конъюгатов на основе видоспецифических моноклональных антител, направленных к О-антигену V. cholerae O1 и O139 81
4.2 Получение пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител, направленных к мембранным белкам, для детекции холерных вибрионов О1, О139 серогрупп с генотипом tcpА+ 86
4.3 Наработка экспериментальных серий холерных видоспецифических пероксидазных препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов 87
4.4 Оценка специфической активности пероксидазных препаратов после лиофилизации и в процессе хранения 96
Глава 5 Применение МКА, меченых пероксидазой хрена, для идентификации и дифференциации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в ИФА и дот-ИФА 98
5.1 Подбор оптимальных режимов постановки ИФА и дот-ИФА с применением моноклональных пероксидазных конъюгатов в стационарных и полевых условиях (без приборного обеспечения) 98
5.2 Использование моноклональных пероксидазных конъюгатов для выявления штаммов с генотипом tcpА+ 103
5.3 Использование моноклональных диагностических препаратов в схеме лабораторной диагностики холеры 105
5.3.1 Применение иммуноферментных методов и моноклональных диагностических препаратов для выявления возбудителя холеры в условиях работы СПЭБ 105
5.3.2 Использование моноклональных пероксидазных конъюгатов в процессе мониторинга холеры 106
Заключение 108
Выводы 121
Список литературы 123
