Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .20
1.1.Характеристика анаммокс-бактерий 20
1.1.1. Особенности строения клеток анаммокс-бактерий .20
1.1.1.1.Морфология 20
1.1.1.2. Ультраструктурная организация клеток анаммокс-бактерий 21
1.1.1.3. Особенности строения клеточных мембран .22
1.1.3. Метаболизм анаммокс-бактерий .23
1.1.4.Ассимиляция углерода
1.1.5. Физиология анаммокс-бактерий .27
1.1.6. Разнообразие анаммокс-бактерий 31
1.1.6.1.Статус Candidatus для прокариот, не существующих в виде чистых
культур, и порядок его присвоения 31
1.1.6.2. Филогенетическое положение анаммокс-бактерий среди представителей филума Planctomycetes .32
1.2. Экология анаммокс-бактерий 35
1.2.1. Роль анаммокс-бактерий в глобальном цикле азота 35
1.2.1.1. Сосуществование и образование молекулярного азота анаммокс-бактериями и денитрификаторами .36
1.2.1.2. Процессы «неклассической» денитрификации и нитратредукции 37
1.2.1.3. Процесс нитрификации 38
1.2.1.4. Диссмиляционная нитратредукция 39
1.2.1.4. Азотфиксация 39
1.2.2. Экологические особенности анаммокс-бактерий .39
1.2.3. Распространение анаммокс-бактерий, принадлежащих к разным родам, и динамика состава анаммокс-сообществ во времени 40
1.2.4. Анаммокс-бактерии природных мест обитания .44
1.2.4.1. Анаммокс-бактерии в почве и болотах 44
1.2.4.2. Морские анаммокс-бактерии 45
1.2.4.3 Анаммокс-бактерии в пресноводных сообществах 47
1.2.5 Анаммокс-бактерии антропогенных мест обитания .48
1.2.5.1. Роль анаммокс-бактерий в искусственных болотах (constructed wetlands) и рисовых чеках .48
1.2.5.2. Анаммокс-бактерии в составе сообществ биореакторов по очистке сточных вод 50
1.2.6. Микроорганизмы, сопутствующие анаммокс-бактериям в различных сообществах, и взаимоотношения с ними .53
1.2.6.1. Нитрифицирующие микроорганизмы 56
1.2.6.2. Денитрифицирующие микроорганизмы .59
1.2.6.3. Микроорганизмы трихомной морфологии .60
1.2.6.4. Метаногены .64
2.3. Биоплёнки анаммокс-бактерий и их спутников .64
1.3.1. Типы биоплёнок .65
1.3.1.1. Тонкослойные биоплёнки 65
1.3.1.2. Гранулы 66
1.3.1.3. Флоккулы .72
1.3.2. Формирование биоплёнок .73
1.4. Применение анаммокс-бактерий в биотехнологии 75
1.4.1. Технологии очистки сточных вод, основанные на использовании биоплёнок
анаммокс-бактерий .75
1.4.2. Использование анаммокс-бактерий для очистки иловых вод 81
ГЛАВА 2. Материалы и методы 83
2. 1. Объект исследования .83
2.2.Использованные среды 83
2.3. Культуральные методы 84
2.3.1. Проточное культивирование анаммокс-сообщества в лабораторном биореакторе 84
2.3.2. Определение скорости потребления субстратов 85
2.3.3. Определение скорости роста .86
2.4. Химические анализы .86
2.4.1.Отбор проб .86
2.4.2. Определение значения рН 86
2.4.3. Определение концентрации ионов аммония, нитрата и нитрита .86
2.4.4. Методики определения газообразных продуктов 87
2.3.5. Исследование липидного состава мембран клеток анаммокс-бактерий..87
2.5. Предобработка образцов биомассы для микроскопических и молекулярно генетических исследований 88
2.5.1. Фиксация образцов 88
2.5.2. Обработка образцов ультразвуком .88
2.5.3. Приготовление ультратонких срезов 88
2.5.4. Окрашивание 89
2.5.5. Нефлуоресцирующие красители 89
2.5.6. Флуоресцирующие красители 89
2.6. Микроскопия .89
2.6.1. Фазово-контрастная и эпифлуоресцентная микроскопия 89
2.6.1. Электронная микроскопия 90
2.6.2. Атомно-силовая микроскопия 90
2.6.3. Конфокальная микроскопия 92
2.7. Молекулярно-генетические исследования .92
2.7.1. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 92
2.7.2.Секвенирование гена 16S рРНК 93
2.7.2.1.Выделение и очистка ДНК 93
2.7.2.2. Амплификация фрагментов генов 98
2.7.2.3. Молекулярное клонирование .100
2.7.2.4. Секвенирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей .101
2.7.2.5. Построение филогенетических дендрограмм 102
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение .103
3.1. Получение и описание новой монокультуры анаммокс-бактерии Candidatus Jettenia asiatica ecosi, активной в широком диапазоне концентраций азотных субстратов и рН 103
3.1.1. Автоселекция микробного сообщества, осуществляющего процесс анаммокс, при длительном культивировании в лабораторном up-flow биореакторе .103
3.1.2 Изменение филогенетического состава анаммокс-сообщества биореактора в ходе длительного культивирования 106
3.1.3.Описание монокультуры анаммокс-бактерий Candidatus Jettenia asiatica ecosi .110
3.1.3.1. Морфология и ультраструктура .110
3.1.3.2. Скорость роста .112
3.1.3.3. Потребление субстратов при периодическом культивировании .113
3.1.3.4. Липидный состав клеточных мембран 115
3.1.3.5. Описание филотипа Candidatus Jettenia asiatica ecosi 117
3.2. Разнообразие микроорганизмов, сопутствующих анаммокс-бактериям в сообществе биореактора 117
3.2.1. Состав микроорганизмов-спутников по данным секвенирования последовательностей генов 16S рРНК .117
3.2.2. Состав сообщества микроорганизмов-спутников по данным микроскопических исследований и FISH 122
3.3. Биоплёнки, сформированные сообществом биореактора в проточных условиях 127
3.3.1. Два типа биоплёнок, сформированных в ходе длительного проточного культивирования 127
3.3.2.1. Строение сферических биоплёнок (гранул) по результатам электронной и конфокальной микроскопии 128
3.3.2.2. Строение тонкослойных биоплёнок 132
3.3.2. Динамика формирования тонкослойных биоплёнок de novo при проточном культивировании .133
3.4. Использование активных гранул монокультуры анаммокс-бактерий для пуска нового лабораторного реактора, входящего в систему очистки иловой воды .139
3.4.1. Подготовительный запуск и вывод на рабочий режим системы реакторов частичной нитрификации-анаммокс на минеральных средах с азотными субстратами 139
3.4.1.1. Подготовительный запуск реакторов на минеральной среде 140
3.4.1.2. Работа сопряжённых реакторов на минеральной среде 141
3.4.1.2. Работа сопряжённых реакторов на иловой воде 143
3.4.2. Филогенетический состав сообществ реакторов частичной нитрификации и анаммокс 146
Заключение .148
Выводы 150
Список литературы
