Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных источников 11
1.1 Концепция раковых стволовых клеток (РСК) 11
1.1.1 Современные представления о возникновении и прогрессии опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки. 11
1.1.2 Основные отличия РСК от дифференцированных раковых клеток
1.1.2.1 Особенности роста in vivo и in vitro 16
1.1.2.2 Экспрессия специфических поверхностных и внутриклеточных маркеров. 20
1.1.2.3 Эксклюзия флуоресцентных красителей . 29
1.2 РСК при колоректальном раке человека 33
1.2.1 Колоректальный рак: классификация, этиология, патогенез 33
1.2.2 Доказательства существования РСК при колоректальном раке человека 38
1.2.3 Молекулярные отличия РСК и дифференцированных раковых клеток при колоректальном раке человека 41
1.3 Новые подходы прогнозирования течения и терапии онкологических заболеваний на основе результатов исследования РСК 44
1.3.1 Корреляция численности РСК и клинического исхода заболевания 44
1.3.2 Сигнальные пути, характерные для РСК 45
1.3.3 Сигнальные пути РСК в качестве мишеней для терапии 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1. Опухолевый материал 51
2.1.1. Получение опухолевого материала 51
2.1.2. Приготовление суспензии опухолевых клеток 51
2.1.3. Определение жизнеспособности клеточной культуры при помощи МТТ-теста 52
2.2. Клеточные линии 53
2.2.1. Культивирование клеточных линий 53
2.2.2. Анализ контаминации клеток микоплазмой 53
2.3 Проточная цитометрия: подготовка проб и проведение анализа 54
2.3.1. Подготовка проб к анализу поверхностных маркеров клеток 54
2.3.2. Анализ поверхностных маркеров клеток 55
2.3.3. Окрашивание клеток витальным красителем DyeCycle Violet (DCV) 56
2.3.4. Окрашивание клеток витальным красителем Rhodamine 123 (Rh 123) 56
2.3.5. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя DCV 57
2.3.6. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя Rh 123 58
2.4 Клеточная сортировка 58
2.4.1. Подготовка проб для клеточной сортировки 58
2.4.2. Проведение клеточной сортировки 58
2.5 Протеомный анализ 59
2.5.1 Экстракция белка из образцов клеток 59
2.5.2 Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров 59
2.5.3 Хроматографическое разделение пептидов 61
2.5.4 Масс-спектрометрическая регистрация пептидов c помощью высокоразрешающего прибора Orbitrap Velos 61
2.5.5 Идентификация масс-спектрометрических данных в программном обеспечении Mascot 62
2.5.6 Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS 62
2.5.7 Анализ данных сравнительного протеомного анализа 63
2.6 Статистический анализ данных 63
ГЛАВА 3. Результаты исследования 64
3.1 Анализ гетерогенности клеточного состава опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой 64
3.2 Исследование экспрессии маркера СD133, ассоциированного с раковыми стволовыми клетками, в образцах опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой. 71
3.3 Выявление раковых стволовых клеток на основе анализа эксклюзии витальных красителей - метод «боковой популяции» 79
3.4 Анализ экспрессии CD133 на клетках «боковой популяции» 88
3.5 Сравнительный анализ экспрессии поверхностных молекул на РСК колоректальной аденокарциномы и на дифференцированных раковых клетках 92
3.6 Сравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии CD133 из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой. 99
3.7 Cравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии CD133 в клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 110
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 119
4.1 Численность CD133-позитивных РСК варьирует в образцах колоректальной аденокарциномы, полученных от пациентов 119
4.2 Процент CD133-позитивных клеток в «боковой популяции» не повышен относительно общей популяции раковых клеток. 120
4.3 РСК из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой характеризуются повышенным уровнем экспрессии белков, связанных с возникновением и прогрессированием злокачественных опухолей . 123
4.4 Профили белков РСК клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 и опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой имеют существенные отличия. 126
Заключение 129
Выводы 131
Список сокращений 132
Список литературы 133
