Введение
Глава 1. Обзор литературы. Амилоиды и прионы – сходства и различия 13
1.1. Амилоиды 13
1.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов 18
1.3.Функциональные и патологические амилоиды 27
1.3.1. Функциональные амилоиды 27
1.3.2. Патологические амилоиды 31
1.3.2.1. Системный амилоидоз АА 31
1.3.2.2. Латеральный склероз 32
1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера 32
1.3.2.4. Болезнь Хангтингтона 36
1.4. Прионы 37
1.4.1. Прионы млекопитающих 37
1.4.1.1. Прионный белок PrP 37
1.4.1.2. Альфа – синуклеин 40
1.4.1.2.Белок tau 41
1.4.2. Прионы низших эукариот 42
1.4.2.1. Фактор [URE3] 44
1.4.2.2. Фактор [PSI+] 46
1.4.2.3. Фактор [PIN+] 48
1.4.2.4. Фактор [SWI+] 49
1.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3+], [OCT+] и [MOD+] 50
1.4.2.6. Факторы [] и [GAR+] 52
1.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina 53
1.4.3. Функциональная значимость прионов 55
1.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на регуляцию протеомных сетей
1.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании прионов и амилоидов 65
ГЛАВА 2. Материалы и методы 68
2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 68
2.2. Плазмиды 76
2.3. Методы дрожжевой генетики 86
2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 87
2.5. Метод бицистронной люминесценции 88
2.6. Флуоресцентная микроскопия 89
2.7. Иммунохимический анализ белков. 91
2.7.1. Выделение белка из дрожжей 91
2.7.2. Дифференциальное центрифугирование 93
2.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы К 93
2.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация 93
2.8. Протеомный метод выявления и идентификации амилоидов PSIA 96
2.8.1. Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами 97
2.8.2. Разделение и идентификация белков 98
2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE) 98
2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE 100
2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (LC-MALDI) 101
2.9. Статистические методы 102
ГЛАВА3. Экспериментальные исследования и обсуждение 103
3.1. Прионный фактор [NSI+] 103
3.1.1. Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического детерминанта [NSI+] 103
3.1.2. Ap-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSt] 106
3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции 107
3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+] ПО
3.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 118
3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявления [NSI+] 118
3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] 121
3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов» 126
3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов» 126
3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме [NSI+] 137
3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты в штамме [NSI+] 137
3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+] 141
3.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] 146
3.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей 154
3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом A в дрожжах S. cerevisiae 157
Заключение 166
Выводы 171
Список сокращений 172
Список литературы 175
