Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Классификация, структура и свойства вируса бешенства .13
1.1.1 Классификация лиссавирусов 13
1.1.2 Морфология и структура вируса бешенства 17
1.1.3 Репродукция вируса бешенства 18
1.2 Эпизоотологические особенности бешенства 21
1.2.1 Ситуация с бешенством в РФ 21
1.2.2 Бешенство в других странах мира .25
1.3 Диагностика бешенства 28
1.3.1 Метод флуоресцирующих антител и его аналоги 29
1.3.2 Выделение вируса бешенства как метод диагностики 31
1.3.3 Серологические методы диагностики 32
1.3.4 Молекулярные методы диагностики и исследования 34
1.4 Профилактика бешенства у человека и животных 35
1.4.1 Штамммы вирусов бешенства, применяемые при производстве антирабических вакцин 36
1.4.2 Антирабические вакцины 41
1.4.3 Рекомендации к антирабическим вакцинам .47
1.4.4 Адъюванты для антирабических вакцин 48
Глава 2. Собственные исследования 51
2.1 Материалы и методы 51
2.1.1 Материалы 51
2.1.1.1 Вирусы 51
2.1.1.2 Культуры клеток 51
2.1.1.3 Референтные сыворотки 51
2.1.1.4. Экспериментальные животные 51
2.1.1.5 Адъюванты .51
2.1.1.6 Коммерческие ИФА наборы 51
2.1.1.7 Среды и растворы 52
2.1.1.8 Реагенты .52
2.1.1.9 Оборудование .53
2.1.2 Методы 53
2.1.2.1 Культивирование вируса бешенства штамм ERA-CB 20М .53
2.1.2.2 Культивирование штамма СVS-11 вируса бешенства .55
2.1.2.3 Титрование вируса в культуре клеток 56
2.1.2.4 Определение инфекционной активности вируса .57
2.1.2.5 Титрование вируса на белых беспородных мышах 57
2.1.2.6 Инактивация вируса бешенства штамм ERA-CB 20М .57
2.1.2.7 Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой 57
2.1.2.8 Антигенные свойства .58
2.1.2.9 Определение титра антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных методом FAVN .58
2.1.2.10 Определение патогенности вируса для животных 62
2.1.2.11 Определение иммуногенной активности методом NIH на белых беспородных мышах 63
2.1.2.12 Индикация вируса бешенства .63
2.1.2.13 Выделение РНК 65
2.1.2.14 Получение кДНК .66
2.1.2.15 Проведение ПЦР 66
2.1.2.16 Очистка образцов из геля .68
2.1.2.17 Секвенирование 68
2.1.2.18Анализ результатов секвенирования 69
2.1.2.19 Статистическая обработка результатов 70
Глава 3. Результаты собственных исследований 71
3.1 Изучение культуральных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CВ 20М .71
3.1.1 Определение спектра наиболее чувствительной линии клеток для получения вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20M 71
3.1.2 Количественное определение гликопротеина вируса бешенства .73
3.1.3 Оптимизация условий получения гликопротеина вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства 76
3.1.4 Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вакцинного вируса штамм ERA-CВ 20М .80
3.1.5 Изучение иммунобиологических свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-СВ 20М 81
3.1.6. Изучение нейровирулентных и патогенных свойств штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 85
3.1.7 Изучение антигенных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20M в опытах на лабораторных и диких животных 91
3.1.8 Определение иммуногенной активности вакцины из штамма ERA-CB 20M 91
3.1.9 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов N- и G – белка штамма ERA-СВ 20М вируса бешенства 92
3.2 Разработка экспериментальной серии вакцины против бешенства из штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 95
3.2.1 Подбор адъюванта 95
3.2.2 Изготовление экспериментальных образцов антирабических вакцин для собак и кошек 98
3.2.3 Оценка безвредности, антигенной активности и стабильности вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» в лабораторных условиях 99
3.2.3.1 Определение внешнего вида и цвета 99
3.2.3.2 Определение стерильности .100
3.2.3.3 Определение безвредности и реактогенности .100
3.2.3.4 Определение иммуногенной активности 101
3.2.3.5 Определение антигенной активности вакцины «Рабикс» 102
3.2.3.6 Определение антигенной активности вакцины «Рабифел» 103
3.2.3.7 Оценка антигенной активности вакцины «Рабикс» на естественно-восприимчивых животных 104
3.2.3.8 Оценка антигенной активности вакцины «Рабифел» на естественно-восприимчивых животных .105
3.2 Разработка ИФА-тест системы для первичного скрининга полученных пулов культурального вируссодержащего материала из штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 106
3.2.1 Разработка тест системы ИФА на основе МКА 1С5 для определения G- белка в вакцинных полуфабрикатах 106
3.2.2 Сравнительное определение белка методом ИФА с зарубежными аналогами иммуноферментного анализа для определения гликопротеина 108
3.2.3 Анализ зависимости значения количества гликопротеина методом ИФА от индекса иммуногености вакцинного препарата методом NIH .111
4. Обсуждение 114
Выводы 125
Практические предложения .126
Список литературы
