Введение
П. Литературный обзор 11
П.1. Деградация мРНК с преждевременным стоп-кодоном 11
П. 1.1. Биологическое значение механизма NMD 11
II. 1.2. Механизм распознавания преждевременного стоп-кодна 15
П. 1.3. Уничтожение мРНК, в которой аппарат NMD обнаружил
преждевременный стоп-кодон 28
П.2. Посттранскрипционное умолкание генов (Posttranscriptional genes silencing, PTGS) 32
11.2.2. Индуцируемый РНК комплексумолкания генов 39
П.2.3. Системноеумолкание генов 40
П. 2.4 РНК-зависимое подавление транскрипции 42
II. 2.5 Вирусные супрессоры УГ. 42
II.3.Взаимодействие механизмов NMD и PTGS 45
III. Методы и материалы 46
III. 1. Реактивы 46
Ш.2. Ферменты и наборы 46
Ш.З. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 46
Ш.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК 48
Ш.4.1. Выделение плазмидной ДНК. 48
111.4.2. Электрофорез в агарозе 49
111.4.3. Рестрикция. Достраивание выступающих концов ДНК. Дефосфорилирование вектора 49
111.4.4. ЛигированиеДНК. 50
111.5. Количественный анализ РНК из высечек листьев N. bentamiana 50
111.5.1. Агроинфильтрация листьев N. bentamiana 50
111.5.2. Выделение РНК. 50
111.5.3. Нозерн-блот гибридизация 51
Ш.5.4. Изготовление одноцепочечного ДНК зонда 52
III. 5.5. Получение кДНК из РНК. 52
111.6. Получение генноинженерных конструкций 53
III.6.1. Клонирование конструкций GFP, Stop! 11, Stop360 и Stopl5 53
III. 6.2. Клонирование конструкций GFP-mRFP, GFPmRFPf. 53
III. 6.3. Клонирование конструкций GFP-X. 54
III6.4. Создание конструкции 35S-HGFP-RFP и 35S-GFP-IRES-RFP 54
111.6.5. Создание конструкцииPVX.GFP-RFP иPVX.GFPRFP/. 55
111.6.6. Клонирование конструкций Stop360рА и Stopl5рА 55
111.6.7. Создание конструкции 35S-GFP-h(MS2)-RFP, 35S-GFP-ash(MS2)-RFP, 35S-GFP-4Xh(MS2)-RFP и 35S-GFP-4Xash(MS2)-RFP 55
111.6.8. Создание конструкции 35S-CP(MS2) и 35S-CP(MS2)PABPf. 56
VI. Результаты и обсуждения 57
VI. 1. Чужеродные «нонсенс-РНК» деградируют в растительной клетке по механизму NMD 57
мРНК с длинными З-НТО накапливаются с низкой эффективностью и редко встречаются в растительных клетках 60
VI.2. Деградация РНК с протяжённой З-НТО, как и деградация «нонсенс» РНК, зависит от её трансляции 65
VI.3. Вирусные субгеномные мРНК с протяженной З-НТО не подвержены NMD в растительной клетке 67
VI.4. В растениях, распознавание преждевременного стоп-кодона определяется его отдаленностью от поли-А хвоста мРНК 70
VI.5. Связывание РАВР с аберрантой мРНК вблизи ПСК стабилизирует
матрицу 72
VI.6. Белок томбусвирусов р19, связывающий siPHK не влияет на процесс специфической деградации аберрантных мРНК в растениях 75
VI.7. Деградация аберрантных мРНК не связана с образованием siPHK .76
VI.8. Деградация мРНК, обладающих длинной З-НТО не вызывает
разрушение РНК сходной последовательности 77
V. Выводы 81
Список литературы
