Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Физиология, распространение и видовое разнообразие бактерий рода Geobacillus 11
1.2. Биотехнологический потенциал бактерий рода Geobacillus 14
1.3. Молекулярно-биологические методы, используемые в таксономии бактерий и изучении микробных сообществ 19
1.4. Гены ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий 30
1.4.1. Система окисления н-алканов у Pseudomonas putida GPo1 30
1.4.2. Организация alk генов у других грамотрицательных бактерий – 37 деструкторов н-алканов .
1.4.3. Организация генов деградации н-алканов у грамположительных бактерий 39
1.5. Строение и функции гиразы и топоизомеразы IV у бактерий 43
1.6. Заключение по обзору литературы 46
Экспериментальная часть 50
2. Объекты и методы исследования 50
2.1. Бактериальные штаммы 50
2.2. Состав сред и условия культивирования бактерий рода Geobacillus 51
2.3. Выделение ДНК и РНК 52
2.4. Обратная транскрипция 54
2.5. Создание праймеров, специфичных к генам gyrB и parE 54
2.6. Амплификация генов 16S рРНК, gyrB, alkB и раrЕ 55
2.7. Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов 57
2.8. Филогенетический анализ полученных последовательностей и построение филогенетических деревьев 58
2.9. Использование ПЦР в режиме реального времени для изучения синтеза мРНК генов alkB 58
3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Определение первичной структуры генов гиразы (gyrB) и топоизомеразы IV (parE) у бактерий рода Geobacillus 60
3.2. Идентификация представителей рода Geobacillus на основе сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК и генов gyrB и топоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл 65
3.3. Поиск генов ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus и определение первичной структуры алкан-гидроксилаз 74
3.3.1. Амплификация и сравнительный филогенетический анализ генов alkB геобацилл 74
3.3.2. Анализ нуклеотидного состава alkB-генов и использования кодонов 80
3.4 Исследование гомологов алкан-монооксигеназы alkB у G. subterraneus K 85
3.4.1 Локализация генов alkB в геноме углеводородокисляющей бактерии Geobacillus subterraneus штамм К 86
3.4.2 Детекция мРНК генов alkB у бактерии G. subterraneus K при росте на н-алканах 89
3.5. Филогенетическое разнообразие генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного
нефтяного пласта 96
4. Заключение 102
5. Выводы 104
6. Список литературы 105
