Введение
I.Введение 7
1.1 Актуальность темы 7
1.2 Цель и задачи работы 9
1.3 Новизна исследования 9
1.4 Научная и практическая значимость 10
1.5 Положения, выносимые на защиту 11
II. Обзор литературы 13
11.1 Бактериофаги и их разнообразие 13 II.
1.1 Классификация бактериофагов 13 II. 1.2 Разнообразие жизненных циклов бактериофагов 14
11.2 Основные механизмы эволюции бактериофагов 16
11.3 Экология бактериофагов - общие принципы 20
11.3.1 Основные принципы экологии бактериофагов в природных микробных сообществах 20
11.4 Экология бактериофагов в симбиотических микробных сообществах человека и животных 31
II.4.1. Количество и разнообразие бактериофагов в микрофлоре животных 32
11.4.2 Экология культивируемых бактериофагов 39
11.4.3 Взаимодействия фаг-клетка - экологически значимые особенности 49
II. 4.4 Прямое взаимодействие фаговых частиц с тканями и клетками макроорганизма 50
П.5. Бактериофаг Т4. Семейство Т4-подобных бактериофагов 56
11.5.1 Общая характеристика группы 56
11.5.2 Фибритины Т4-подобных бактериофагов 61 П.6. Фолдинг белка 65
11.6.1 Общие закономерности фолдинга 65
11.6.2 Формирование структуры coiled coil 70 II.7. Особенности олигомеризации и фолдинга фибритина фага Т4
7.1 С-концевой домен (фолдон) и инициация фолдинга фибритина 75
III. Материалы и методы 78
111.1 Плазмиды, штаммы бактерий и бактериофагов и их культивирование 78
111.2 Выделение бактериофагов и колиформных бактерий 80
111.3 Создание библиотек случайных клонов геномов бактериофагов, клонирование и выделение плазмидной ДНК 81
111.4 ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и секвенирование 82
II.5. ПЦР-фингерпринтинг энтеробактерий 84
III.6 Электронная микроскопия 85
III.7. Экспрессия белков и анализ на растворимость 85
111.8 Ограниченный протеолиз 87
111.9 Предсказание вторичной и третичной структуры белковых доменов 87
111.10 Получение мутантов фага Т4 по гену 36 87
111.11 Тестирование ингибирующего действия ПЭГ на адсорбцию фага Т4и его мутантов 88
III.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия 88
III.13 Солюбилизация тел включения и рефолдинг белка in vitro. 89
III. 14 Выделение и очистка некультивируемого вирусного сообщества фекалий.
IV. Результаты и обсуждение 91
IV.1 Установление роли С-концевого домена фибритина фага Т4 в
инициации фолдинга данного белка 91
IV.1.1. Исходные предпосылки и методический подход 91
IV.1.2 Неспособность последовательности coiled coil участка фибритина инициировать тримеризацию и фолдинг .
IV.1.3 Доказательство способности С-концевого домена к независимой тримеризации 95
IV.1.4 Поиск мутаций, стабилизирующих мономерный интермедиат фолдинга 100
IV.1.5 Реконструкция пути фолдинга фибритина фага Т4 106
IV.2. Исследование эволюционной пластичности генов фибритина у бактериофагов, родственных Т-четным 107
IV.2.1. Определение последовательностей генов фибритина у псевдо-Т чётных и шизо-Т-чётных бактериофагов 108
IV.2.1. Особенности эволюции генов фибритина. 109
IV.2.2 Экспрессия и физико-химическая характеристика гомологов фибритина фага Т4 120
IV.2.3 Пластичность генов дистальной части ДХФ - потенциальной мишени связывания пг wac 130
IV.2.4 Генетический анализ взаимодействия фибритин - ДХФ 132
IV.2.5 Анализ эволюционной пластичности фибритина в контексте эволюции геномов бактериофагов, родственных Т-чётным 135
IV.3 Исследование экологии и микроэволюции колифагов в природном микробном сообществе 139
IV.3.1. Выбор модельного микробного сообщества 139
IV.3.1. Анализ морфологического разнообразия вирусоподобных частиц в фекалиях лошадей 141
IV.3.2. Анализ временной динамики популяций колифагов в фекалиях лошадей культуральными методами 147
IV.3.3. Разработка метода высокоразрешающей дифференциации штаммов колиформных бактерий и анализ внутривидовой гетерогенности их популяций у лошадей 149
IV.3.4 Оценка уровней внутривидового разнообразия колиформных бактерий в индивидуальных микробиомах лошадей 158
IV.3.5 Исследование разнообразия колифагов в индивидуальных микробиомах лошадей 159
IV.4 Исследование полиморфизмов генов адсорбционного аппарата у экологически связанных изолятов колифагов 167
IV.4.1 Модульные перестановки генного уровня в адсорбционном аппарате изолятов Ы4-подобных бактериофагов 169
IV.4.2 Модульные перестановки субгенного уровня в адсорбционном аппарате изолятов Т5-подобных бактериофагов 174
IV.5. Заключение 179
V. Выводы 182
VI Публикации по теме диссертации 184
VII Список литературы
