Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Представители класса Mollicutes: особенности биологии микоплазм и проблема контроля микоплазменных инфекций 13
1.1.1. Клеточная биология микоплазм и особенности организации клеток A. laidlawii PG8 16
1.1.2. Молекулярная биология микоплазм: геном, протеом и патогенность A. laidlawii PG8 20
1.1.3. Микоплазменная контаминация клеточных культур: феноменология, диагностика и подавление 28
1.2. Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам и внеклеточные везикулы бактерий 30
1.3. Молекулярно-генетические основы адаптации к антибактериальным препаратам и резистом микроорганизмов 40
Экспериментальная часть 51
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1. Культивирование A. laidlawii PG8В на искусственных питательных средах 51
2 .2. Получение различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii PG8B 52
2.3. Определение численности колониеобразующих единиц A. laidlawii PG8B 53
2.4. Микроскопический анализ клеток и внеклеточных везикул 53
2.4.1. Трансмиссивная электронная микроскопия 53
2.4.2. Атомно-силовая микроскопия 54
2.4.3. Сканирующая электронная микроскопия 55
2 .5. Определение эффлюкса ципрофлоксацина 55
2.6. Определение чувствительности A. laidlawii к антибиотикам
методом серийных разведений (определение МИК) 56
2 .7. Выделение и очистка внеклеточных везикул из культур различающихся по чувствительности к АБП штаммов A. laidlawii 56
2 .8. Определение содержания АБП во внеклеточных везикулах штаммов A. laidlawii 57
2.9. Анализ внеклеточных везикул A. laidlawii на генотоксичность 58
2.10. Протеомный анализ клеток и внеклеточных везикул A. laidlawii PG8B: электрофоретическое разделение и идентификация белков с помощью 1D-LC-ESI-MS/MS 58
2 .11. Определение внутриклеточной локализации и функций белков штаммов A. laidlawii 60
2 .12. Выделение и очистка нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из клеток и внеклеточных везикул A. laidlawii 60
2 .13. Реакции обратной транскрипции и амплификации нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР 61
2 .14. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 63
2 .15. Количественная ПЦР в реальном времени 63
2 .16. Клонирование и секвенирование нуклеотидных
последовательностей генов A. laidlawii 65
2 .17. Полногеномное секвенирование штаммов A.laidlawii 66
2 .18. Статистическая обработка полученных данных 67
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3 .1. Штаммы A. laidlawii, различающиеся по чувствительности к ципрофлоксацину: получение и характеристика в отношении везикуляции и эффлюкса антибиотика 68
3 .2 Сравнительный анализ состава нуклеотидных последовательностей ДНК A. laidlawii во внеклеточных везикулах у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов микоплазмы 78
3 .3. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей ДНК клеток у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii 83
3.4. Сравнительный анализ протеомов клеток у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii 98
3 .5. Сравнительный анализ протеомных профилей внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii 103
3 .6. Сравнительный анализ генотоксичности внеклеточных везикул у различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A.laidlawii 109
Заключение 113
Выводы 118
Список литературы
