Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 17
1.1. Фермент микробного происхождения - циклодекстринглюкано-трансфераза 17
1.2. Циклодекстриногенные бактерии 19
1.2.1. Paenibacillus macerans 19
1.2.2. Bacillus circulans 20
1.2.3. Алкалофильные бациллы 21
1.2.4. Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН 21
1.2.5. Термотолерантные циклодекстриногены 22
1.2.6. Продуценты ЦГТ-аз, не относящиеся к порядку Bacillales 22
1.3. Выбор продуктивного штамма для процессов получения ЦГТ-азы 23
1.3.1. Источники культур 23
1.3.2. Накопительные среды 24
1.3.3. Дополнительный анализ выделенных штаммов 24
1.4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов-
продуцентов ЦГТ-аз 25
1.4.1. Источники углерода 25
1.4.2. Источники азота 26
1.4.3. Источники фосфора 26
1.5. Физико-химические свойства бактериальных ЦГТ-аз 27
1.6 Структура ЦГТ-аз 33
1.7. Реакции катализируемые ЦГТ-азами 34
1.7.1. Реакция циклизации 35
1.7.2. Реакция диспропорционирования 37
1.7.3. Реакция связывания 37
1.7.4. Гидролитическая (декстринизирующая) активность 38
1.7.5. Суммарная схема реакции 38
1.8. Методы выделения и очистки ЦГТ-аз 39
1.8.1. Ультрафильтрация 40
1.8.2. Осаждение органическими растворителями 42
1.8.3 .Высаливание 43
1.9. Хроматографические методы очистки ЦГТ-аз 48
1.9.1. Гидрофобная хроматография 49
1.9.2. Ионообменная хроматография 49
1.9.3. Металлохелат аффинная хроматография 51
1.9.4. Аффинная хроматография. Синтез аффинных сорбентов с использованием ЦД 53
1.10. Строение, свойства, методы получения ЦД и комплексов включений 55
1.10.1. Строение ЦД 55
1.10.2. Свойства ЦД 57
1.10.3. Методы получения ЦД 60
1.10.3.1. Типы субстратов для получения ЦД 62
1.10.3.2. Методы предобработки субстратов 63
1.10.4. Комплексы-включения с ЦД 64
1.10.4.1. Получение комплексов в водных растворах ЦД 67
1.11. Применение ЦД в пищевой промышленности 68
ГЛАВА 2.Экспериментальная часть 72
2.1. Объекты, материалы и методы исследований 72
2.1.1. Объект исследования 72
2.1.2. Питательные среды 72
2.1.3. Крахмал, используемый для циклизации 74
2.1.4. Ферментные препараты 75
2.1.5. Ароматические вещества, используемые для получения комплексов включений с а-ЦД 75
2.1.6. Препарат а-ЦД 76
2.1.7. Приборы 76
2.1.8. Методы 77
2.1.8.1. Определение вязкости растворов крахмала 77
2.1.8.2. Определение РВ по методу Шомодьи-Нельсона 78
2.1.8.3. Определение декстрозного эквивалента 78
2.1.8.4. Определение белка по методу Лоури 79
2.1.8.5. Определение содержания влаги в образцах навесок исследуемого вещества 79
2.1.8.6. Методы определения ферментативных активностей 79
2.1.8.6.1. Качественное определение а-ЦГТ-азной активности методом Тильдена-Хадсона 79
2.1.8.6.2. Количественный метод определения активности а-ЦГТ-азы..80
2.1.8.6.3. Определение амилолитической активности фотоколориметрическим методом 82
2.1.8.6.4. Измерение активности р-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом 82
2.1.8.6.5. Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона) 85
2.1.8.7. Концентрирование культуральной жидкости методом ультрафильтрации 86
2.1.8.8. Осаждение ферментов органическими растворителями 86
2.1.8.9 Получение лиофилизированных ферментных препаратов 86
2.1.8.10. Электрофорез 87
2.1.8.10.1. Изучение степени чистоты фермента с помощью диск-электрофореза 88
2.1.8.11. Диализ 88
2.1.8.12. Методы определения физико-химических параметров а-ЦГТ-
азы 88
2.1.8.12.1. Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы 88
2.1.8.12.2. Определение термостабильности а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.3. Определение рН - оптимумов действия а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.4. Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-
азы 89
2.1.8.12.5. Определение влияния ЭДТА и ионов металлов на активность а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.6. Определение аминокислотного состава белка 90
2.1.8.13. Хроматографические методы очистки а-ЦГТ-азы 90
2.1.8.13.1. Гидрофобная хроматография 90
2.1.8.13.2. Синтез аффинных сорбентов а-ЦД- сефароза4В 91
2.1.8.13.3. Аффинная хроматография а-ЦГТ-азы 91
2.1.8.14. Определение ЦД методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии ! 91
2.1.9. Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта : 93
2.1.10. Рецептура кондитерских изделий (конфеты «Помадка сахарная» и «Помадка сливочная»), приготовленных с добавлением комплексов включений 95
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 96
2.2.1 Скрининг ЦГТ-активных культур микроорганизмов из природных мест обитания 96
2.2.2. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма 1024 ^ 100
2.2.3. Филогенетические особенности штамма 1024 105
2.2.4. Питательные среды, оптимальные для культивирования,
поддержания и хранения микроорганизма Paenibacillus macerans 1024 109
2.2.4.1.Хранение и поддержание культуры Paenibacillus macerans 1024 109
2.2.4.2. Выращивание культуры Paenibacillus macerans 1024 на жидких питательных средах 112
2.2.4.3. Изучение влияния рН исходной питательной среды на биосинтез а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024 113
2.2.4.4. Разработка способа получения посевного материала 114
2.2.4.5. Изучение динамики биосинтеза фермента а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024 на оптимизированной по составу питательной среде 116
2.2.5. Определение физико-химических свойств неочищенной а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 117
2.2.5.1.Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 117
2.2.5.2.Определение рН-оптимума а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 118
2.2.5.3.Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-азы Paenibacillus sp. 1024 119
2.2.5.4. Определение температурной стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 120
2.2.6. Разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х из культуральной жидкости продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ 122
2.2.6.1.Подбор условий удаления балластных веществ из культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 123
2.2.6.2.Разработка условий ультрафильтрации для очистки и концентрирования культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 125
2.2.6.2.1.Подбор мембраны для проведения процесса ультрафильтрации культуральной жидкости 125
2.2.6.2.2. Влияние рабочего давления на процесс ультрафильтрации культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 131
2.2.6.2.3. Влияние степени концентрирования раствора а-ЦГТ-азы
Paenibacillus macerans 1АМБ на процесс ультрафильтрации 132
2.2.6.3. Разработка условий получения осажденного ФП а-ЦГТ-азы
Paenibacillus macerans 1 АМБ 136
2.2.6.3.1.Исследование влияния концентраций различных
органических растворителей на выход препарата а-ЦГТ-азы Paenibacillus
macerans 1 АМБ 136
2.2.6.3.2. Влияние различных концентраций этанола (об%) на выход препарата а-ЦГТ-азы из УК 138
2.2.6.3.3. Влияние рН на осаждение а-ЦГТ-азы из УК культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1 АМБ 139
2.2.6.4. Лиофилизация препарата а-ЦГТ-азы 140
2.2.6.5. Исследование физико-химических характеристик ФП а-ЦГТ-азы Г20Х 143
2.2.6.5.1. Определение рН-оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы
Г20Х 143
2.2.6.5.2. Определение рН-стабильности препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 144
2.2.6.5.3. Определение температурного оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 145
2.2.6.5.4. Определение термостабильности препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 145
2.2.6.6.Изучение динамики изменения а-ЦГТ-азной активности в процессе биоконверсии крахмала в а-ЦД 146
2.2.6.7. Анализ микрофлоры ФП а-ЦГТ-азы Г20Х 148
2.2.7. Разработка хроматографических приемов очистки а-ЦГТ-
азы 150
2.2.7.1. Влияние ионов металлов и этилендиаминтетраацетата на
активность а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 150
2.2.7.2. Очистка а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с использованием гидрофобной хроматографии 152
2.2.7.3. Очистка а-ЦГТ-азы с использованием аффинной хроматографии 154
2.2.7.4 Изучение свойств а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1 АМБ 155
2.2.7.4.1. Определение молекулярной массы фермента 155
2.2.7.4.2. Определение аминокислотного состава белка высокоочищенного препарата а-ЦГТ-азы 158
2.2.8. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала вальфа-ЦД 159
2.2.8.1. Исследование поведения 2% растворов крахмала различного типа в процессе термообработки 160
2.2.8.2. Определение выхода а-ЦЦ из различных видов крахмалов под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1 АМБ 161
2.2.8.3. Исследование поведения картофельных крахмалов различных марок в процессе термообработки 163
2.2.8.4.Выбор метода разжижения для приготовления концентрированных растворов картофельного крахмала 164
2.2.8.4.1. Химический гидролиз крахмала 165
2.2.8.4.2. Предобработка крахмала ультразвуком 167
2.2.8.4.3. Ферментативная предобработка крахмала в биотехнологии ЦД 168
2.2.8.4.3.1.Предобработка крахмала ферментными препаратами а-амилаз 168
2.2.8.4.3.2. Предобработка крахмала солодовой вытяжкой 173
2.2.8.4.3.3. Предобработка крахмала а-ЦГТ-азами 175
2.2.8.5.Определение выхода а-ЦД из картофельного крахмала, предобработанного различными методами под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 177
2.2.8.6. Интенсификация процесса получения ЦД с использованием комплексной предобработки крахмала 179
2.2.8.6.1. Последовательная предобработка крахмального
клейстера УЗ и а-ЦГТ-азами {Paenibacillus macerans 1024 и Paenibacillus macerans 1 АМБ) 179
2.2.8.7. Лабораторная двухступенчатая схема получения а-ЦД с
использованием УЗ и а-ЦГТ-азы Г10Х Paenibacillus macerans 1024 для
предобработки крахмального клейстера и а-ЦГТ-азы Г20Х Paenibacillus macerans 1 АМБ для циклизации 182
2.2.9. Получение комплексов включений ароматических веществ с а-ЦД 184
2.2.9.1 Получение комплекса включения а-ЦД с -кристаллическим ванилином 184
2.2.9.2 Получение комплекса включения а-ЦД с эфирным маслом апельсина 187
2.2.10. Апробация комплексов включений ароматообразователей с а-ЦД в технологии помадных конфет 190
2.2.10.1.Приготовление кондитерских изделий по традиционной технологии с применением комплексов включений 191
2.2.10.2. Характеристика кондитерских изделий при хранении 193
Общие выводы 199
Список литературы
